T.U.F.F. Puppy conta a história de um cão hiperativo e não tão inteligente que é recrutado pela agência de combate ao crime T.U.F.F. (sigla para Turbo Undercover Fighting Force [ENG] ou Turbo Unidade Força Feroz [PT-BR]), onde se torna parceiro de Kitty Katswell, uma gata esperta e temperamental. Eles ainda tem a ajuda do Chefe, uma pulga rigorosa mas gentil, e Keswick, o cientista da agência.
Juntos, eles devem manter a cidade de Petropolis, Califórnia, a salvo de vilões, como Verminoso Snaptrap, líder de uma agência do mal chamada D.O.O.M. (sigla de Diabolical Order of Mayhem [ENG] e Diabólica Ordem Ofensiva Mundial [PT-BR]), seguido por Larry, Ollie e Francisco; Camaleão, que possui uma roupa de transformação molecular que lhe permite se transformar em qualquer coisa; e Bird Brain, um "atobá de bumbum azul" e o vilão mais inteligente da cidade. Mais além há Quacky o Pato e o Alce Compartilhador, que se tornam vilões depois de perderem seu show de TV infantil; a F.L.O.P.P. (Fiendish League of Potential Perpetrators), uma agência que comete crimes menores (mas que consideram crueis) liderada por Fuinha (Meerkat)1 ; e o Bacalhau de Capa (Caped Cod na versão original), um bacalhau que, junto ao seu súdito Foca de Aprovação (Seal of Approval), tenta inundar Petropolis para fazer dela seu reino e derrotar Dudley, quem ele pensa ser o rei da cidade.
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